miRNA/piRNA研究工具：Agomir和Antagomir
1. Agomir
“miRNA功能研究来说，miRNA模拟物可以模拟体内成熟的miRNA，它是miRNA功能获得（gain of function）研究的重要工具之一”
模拟成熟的miRNA有两种形式，第一种形式是miRNA mimics（miRNA模拟物），它是一种双链的RNA分子，模拟体内miRNA duplex形式（如上左图），通过转染细胞，从而达到上调成熟miRNA目的。
另一种形式是miRNA agomir，它是一种双链的修饰的RNA分子，模拟体内miRNA duplex形式（如上右图），修饰方式与antagomir是一样的（如下图）。通过转染细胞或者动物体内给药的方法，达到上调成熟miRNA。miRNA agomr特点就是稳定性强，可以满足动物实验的需求。
agomir在反义链进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
2. Antagomir
“miRNA功能研究来说，miRNA抑制剂可干预内源性的miRNA，它是miRNA功能丧失（loss of function）研究的重要工具之一”
最初探索的是利用硫代修饰（phosphorothioate，PS）反义核酸，PS修饰的核酸增强ASO对核酸酶的抗性，但是会一定程度降低其对RNA的亲和力，如果完全PS修饰的ASO可能失去抑制剂miRNA的活性。由于PS修饰大大改善了ASO吸收、组织分布和分泌等等性能，目前使用最为广泛一种修饰就是Antagomir,它选择性在两端的碱基进行PS修饰，同时将2′-O-methyl以及胆固醇等修饰进行组合(见下图)。antagomir不仅具有好的组织兼容性、单碱基特异性、有效性和稳定性的特点。
antagomir 3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
3.piRNA/tRF agomir和antagomir
小非编码RNA的RNA长度在20-35bp，包括微小RNA（microRNAs,miRNAs）,源于核糖体RNA片段（tRNA-derived fragment，tRF),PIWI蛋白作用RNA（PIWI-interacting RNAs ，piRNAs），核仁小分子RNA（C/D snoRNA-derived RNA,sdRNA）和小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）。
piRNA（Piwi-interacting RNA）是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类非编码小RNA，这类小RNA可与Piwi（P-element Induced Wimpy Testis）蛋白家族成员相互作用。
转运RNA (tRNA) 衍生的小RNA (tsRNA) 是一种新型的非编码小RNA，可通过酶从tRNA上切割下
来，在转录和翻译水平调节基因表达。tRNA的化学修饰可以直接影响 tsRNA 的产生和生物学功能。tRNA由70-90个核苷酸组成，是一类具有L形三级结构和“三叶草”形二级结构的RNA，它的主要作用是在mRNA的指导下将氨基酸携带到核糖体中进行蛋白质合成。在这个过程中，tRNA 可以被几种酶特异性切割成许多小片段。tsRNAs主要分为tRNA衍生片段(tRNA-derived RNA fragment，tRF)或tRNA半分子(tRNA halves，tiRNA)，便是来源于tRNA切割的片段。
piRNA和tsRNA具有类似miRNA序列模拟特性，序列较短，容易化学合成，通过修饰增强稳定性，荧光示踪ncRNA分子在体内分布，由此通过piRNA和tsRNA的agomir/antagomir可以部分模拟或者拮抗piRNA/tsRNA功能。
4.agomir和antagomir检测手段
1. 为了分析miRNA/piRNA/tsRNA的表达水平，将agomir/antagomir转染到细胞中，可以通过northern blot印迹和实时荧光定量PCR进行功能验证。
2. 在agomir/antagomir转染细胞和NC对照细胞中分析靶基因的表达水平，采用实时定量荧光PCR和WB检测靶基因的表达水平，验证miRNA与靶基因之间的调控关系。
3.验证分析3‘UTR靶点
对于miRNA而言，通过构建一个或多个预测miRNA 3’UTR结合靶点报告质粒，共转染miRNA与报告质粒，抑制报告基因质粒，从而测试miRNA和预测结合位点之间的关系。我们建议以miRNA agomir/antagomir阴性对照作为参考，阴性对照组的浓度和转染条件与实验组相同。
5.agomir和antagomir优势
6.体内给药推荐剂量
一、局部给药：适应模型：大脑、肌肉、皮肤、眼睛、鼻腔、耳蜗、移植瘤、生殖器等局部组织
1）注射体积和剂量：
agomir推荐剂量：每次注射1~5nmol；
antagomir推荐剂量：每次注射5~20nmol。
2）注射时间：
以移植瘤为例，长至5mm X 5mm大小时开始注射；重复注射2至4周，每三天注射一次。
二、系统给药 适应模型：循环系统（免疫系统）、作用于血流丰富的脏器（肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏）
1）注射体积和计量：
agomir推荐剂量：每次注射5~20nmol；
antagomir推荐剂量：每次注射50~200nmol。
2）注射时间：
针对急性模型（作用时间小于一周），建议单次高剂量注射；
针对慢性模型（作用时间超过一周），建议中低剂量多次给药，每周注射2~3次加强作用效果。
注：以上数据仅供参考，由于miRNA/piRNA/tsRNA本身丰度差异大，作用的部位不一，并无统一剂量标准；建议广大科研工作者，根据预实验的结果调整使用剂量，优化实验方案。
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