手把手教您设计cas13 gRNAs

CRISPR-Cas13是一类由RNA介导的靶向RNA的基因编辑技术，目前已经成为癌症诊断、治疗和基因研究等多应用领域的基因编辑工具。

越来越多的初学者来说，特别是一些医学科研工作者而言，对于实验中需要知道如何使用CRISPR-Cas13系统，特别是最关键的如何快速掌握CRISPR-Cas13 gRNA设计方法。艾博思生物将手把手教您完成如何设计CRISPR-Cas13 gRNA。

Cas13是一种CRISPR-Cas蛋白，它可以通过形成复合物形式帮助你研究和调控哺乳动物细胞中的RNA。Cas13如果想要发挥功能，它需要搜寻您需要修饰或者靶向的RNA。那么就利用一个较短且具有柔性的RNA就比较容易精准定位到你需要靶向的RNA。这种能够通过碱基互补配对方式将Cas13导向目标分子的RNA被称为引导RNA（guide RNA，gRNA）。

什么是gRNA？

CRISPR系统有两个主要组成部分：Cas蛋白（Cas 9、12或13）和gRNA。Cas蛋白具有核酸酶活性，gRNA引导Cas蛋白到达特定的靶点。Cas13的gRNA是一个小RNA，具有保守的序列从而形成茎环结构（也称为直接重复或“DR”）和间隔序列。Cas13与DR结合，间隔序列与目标核酸互补。（图1）

图1 LwaCas13a crRNA（gRNA）:DR(Direct repeat,DR)是Cas13结合的支架，间隔序列(Spacer)以碱基互补的方式引导Cas蛋白到其目标序列。

Cas13 gRNA设计与Cas9有何不同？

Cas9需要两个RNA：

1. 反式激活的CRISPR RNA（tracr-RNA）；

2. CRISPR-RNA（crRNA）。

Cas13只需要一个较短的单一RNA。

Cas13不需要在目标序列旁边的间隔邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）来切割它。一些Cas13蛋白更倾向于位于3‘间隔区侧翼位点（Protospacer Flanking Site，PFS）旁边的腺嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶，但PFS对Cas13核酸酶的活性不是必需的[1]。对PAM没有要求使得靶向RNA变得更容易。理论上，你可以瞄准RNA的任何区域。然而，Cas13蛋白只结合和切割ssRNA。mRNA是单链核酸，但RNA具有二级结构，可以产生环和双链RNA。Cas13的gRNAs靶向RNA的环或单链区域是至关重要的[2]。

我从哪里开始设计Cas13 gRNA？

你需要做的第一件事就是选择你要使用的Cas13蛋白。它可以是Cas13 a、Cas13b、Cas13c、Cas13d等。每种Cas13蛋白都有其优缺点。假设你想使用Cas13a。现在你需要检查哪个细菌来源Cas13a。是Leptotichia buccalis (Lbu), Leptotrichia wadei (Lwa)还是其他菌株？

第一步对于设计gRNAs至关重要，因为它将决定您所需的DR序列。Cas13a与Cas13 b、Cas13 c或Cas13 d结合的DR不同。此外，来自其他菌株的Cas13a蛋白只能识别它们特定的DR，而且你不可能使用LbuCas13a+gRNA用于LwaCas13a，因为它不起作用。

最常用的Cas13蛋白的DR列表见下表1

假设你使用的是LwaCas13a。现在您已经有了DR序列，那么是时候设计间隔序列了。这个间隔序列是一个22-28nt的RNA序列，它告诉Cas13a靶向哪个RNA，并与目标序列互补结合。

下面让我们来讨论如何选择你应该靶向目标RNA的具体区域。

如何设计间隔符序列

Cas13蛋白不需要PAM序列，这使得设计阶段更简单。下面让我们一步一步地告诉您如何操作。

第一步：获取目标RNA的序列

要获得mRNA序列，请到NIH的NCBI网站搜索您感兴趣的基因。我们选择human YTHDF1。在NCBI参考序列部分找到mRNA序列，并下载FASTA序列（图2）。

步骤2：选择目标序列

选择Cas13靶向的RNA区域，选择原则遵循了Wessels和Guo的工作原理。[6,7]（图3）

图3.gRNA设计屏幕截图。根据客户DIY需求上传您的mRNA序列并设计gRNAs。

选择设计DIY gRNA选项。将序列作为FASTA文件上传，如果它小于500个碱基则直接粘贴。点击“设计指南”按钮，就会生成一个包含预测gRNA结果的表格，或通过电子邮件发送给您。

该表给出了每个crRNA的ID、序列、crRNA靶向的RNA区域、预测的效率评分、四分位数值（Q4意味着预测的疗效较高，而Q1的预测疗效较低），以及潜在的脱靶效应。选择具有最高四分位数值（Q4）的gRNAs和指导分数。（图4）

图4.顶部:高亮显示了YTHDF1的潜在gRNAs；底部：gRNAs与mRNA互补位置。

步骤3：考虑异构体

如果你感兴趣的基因有不同的表达亚型，检查你选择的gRNAs是否针对所有的内源性转录本。你可以使用BLAST比对来检测特异性。

第4步：生成gRNAs

你可以让艾博思公司合成gRNA，也可以让我们帮你将crRNA序列克隆到质粒中。

通过搜索Cas13 gRNA，你可以在艾博思克隆crRNA的质粒。你可以选择进行细菌或哺乳动物表达的质粒。

对于哺乳动物的表达，质粒有一个U6启动子，为每个Cas13蛋白特有的DR，一个允许插入crRNA的限制性内切酶位点，和一个转录终止位点。

一旦你的gRNAs/质粒准备好，将它们与Cas13一起通过递送系统运送到您的细胞系中发挥作用。

如何测试你的gRNA

按照精简话原则，类似siRNA设计套装，我们推荐gRNA设计至少测试3个gRNA。在用Cas13和gRNA转染细胞后的48-72小时内，您可以通过检测您感兴趣的转录本的RNA水平。RT-qPCR是经济实惠的方法。如果你的gRNA可以工作，你就检测到转录水平的降低。在后续的功能和其他验证工作中，使用敲低最高的1-2个gRNA作为候选。

友情提示

实验的最初设计是让你的实验结论可靠的最关键的法宝，避免设计上的失误导致实验失败是十分关键的一环，对于初学者尤为重要。

1. gRNA中的DR是你所使用的Cas13蛋白的正确版本所决定的。

2. gRNA的间隔序列与目标RNA是互补的。

3. 记得设计3种不同的gRNA来进行分子表型以及功能。

4. 阴性对照是非特异性排除关键，千万不能省略，多设计1-2个阴性对照，是让你的实验更特异的保障

5. 初学者，对于特定细胞的阳性对照也是练手的帮手，让你的实验体系稳定，可靠以及可重复性。

Cas13缺乏对PAM的要求，这使得为Cas13设计gRNAs比为Cas9设计更容易。然而，还需要考虑其他因素，如靶RNA的结构。虽然很少有网络工具来设计Cas13的gRNA，利用好工具原则，可以推广用于任何Cas13蛋白。

参考文献：

1. Abudayyeh, O. et al. (2016) C2c2 is a single component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353(6299):aaf5573

2. Bandaru S. et al. (2020) Structure-based design of gRNA for Cas13. Sci Rep. 10;11610.

3. Abudayyeh, O. (2017) RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550(7675);280–284.

4. Cox, D. et al. (2017) RNA editing with CRISPR-Cas13. Science, 358;1019–1027

5. Konermann, S, et al. (2018) Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. pii: S0092-8674(18)30207-1.

6. Wessels, HH. et al. (2020) Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nat Biotechnol. 38;722–727.

7. Guo X. et al. (2021) Transcriptome-wide Cas13 guide RNA design for model organisms and viral RNA pathogens. Cell Genomics. 1;100001.