TCA-磷脂-糖酵解靶向三联疗法有效抑制胶质母细胞瘤中ATP的产生和肿瘤生长

背景：三磷酸腺苷(ATP)在能量代谢和细胞信号传递中起着中心作用。肿瘤细胞中合成代谢过程所需的大部分ATP是由有氧糖酵解产生的，即Warburg效应。此外，脂肪酸氧化(FAO)也有助于胶质瘤细胞的生长和增殖。三羧酸(TCA)循环与氧化磷酸化(OXPHOS)结合在一起，在线粒体中合成ATP分子。GBM对这些能量代谢途径重新编程，以产生更高比例的ATP支持癌细胞的快速生长过程。GBM的发病机制在生理上依赖于特定的能量途径，这些途径可以用于治疗靶向。因此，作者推测针对糖酵解和FAO途径的联合治疗，而不是单一治疗策略可能对GBM细胞的增殖产生更明显的抑制作用。

 非编码RNA、DNA甲基化和组蛋白甲基化和乙酰化是在促进肿瘤细胞代谢重编程的功能修饰中发挥关键作用的表观遗传机制。对lncRNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)的机制研究表明，HOTAIR的5‘端区域通过多梳抑制复合体2(PRC2)蛋白的亚基EZH2驱动组蛋白H3在Lys27(H3K27me3)的三甲基化来调节基因的表达。

  本研究证明小分子抑制剂EPIC-0412可以通过有效地破坏lncRNA HOTAIR与EZH2之间的相互作用，进而调节TCA循环。本研究将cPLA2抑制剂AACOCF3和HK2抑制剂2-DG联合小分子抑制剂EPIC-0412抑制GBM细胞中ATP能量的产生。在此，作者研究了抑制ATP的产生对胶质瘤母细胞的细胞周期进程的作用。随后，作者利用患者来源的GBM细胞以及通过植入小鼠脑肿瘤的微渗泵的对流增强输送(CED)来探索靶向能量代谢通路在GBM肿瘤中的治疗效果。结果证明，通过靶向TCA-磷脂-糖酵解轴，三联疗法可以显著抑制肿瘤生长并改善荷瘤小鼠的生存结果。

图一：为了明确小分析抑制剂EPIC-0412是否能够影响胶质母细胞瘤的肿瘤代谢，作者首先通过非靶代谢组学检测经DMSO和小分子抑制剂EPIC-0412处理后的胶质母细胞瘤细胞代谢改变, 随后对明显改变的代谢物（A）进行代谢通路富集分析，发现碳代谢、TCA循环代谢和神经活性配体-受体相互作用是受影响最大的三个代谢途径（B），在此作者关注TCA循环，因为它在细胞的分解代谢和合成代谢活动中都起着关键作用。结果证明EPIC-0412能够下调TCA循环中关键肿瘤代谢物，包括柠檬酸、乌头酸、异戊酸、α-酮戊二酸和富马酸 (C)，并且能够显著降低胶质瘤细胞中的ATP产量（D）。此外，作者课题组在之前已经证实，AACOCF3作为蛋白酶cPLA2的抑制剂，能够阻止ATP合成和细胞增殖。因此AACOCF3作为研究肿瘤生长抑制剂的有力候选者，与EPIC-0412协同抑制胶质瘤细胞中的ATP产生。通过安捷伦seahorseXFe24细胞外通量分析仪检测细胞氧耗率（OCR），细胞的基础呼吸速率和ATP产量 (F-G)。值得注意的是，联合治疗比单一治疗更有效，显示肿瘤细胞线粒体呼吸产生的ATP减少了约70%。此外，荧光素酶检测不同处理组的ATP浓度的改变与OCR测量结果一致(H)。综上所述，线粒体TCA循环被EPIC-0412打乱，脂肪酸氧化FAO被AACOCF3部分阻断，导致细胞代谢总体放缓。总之，这些数据表明，EPIC-0412和AACOCF3联合使用时是很有希望的抗GBM药物。

图二：在证明EPIC-0412能够干扰胶质瘤细胞肿瘤代谢后，接下来作者探讨了小分子抑制剂EPIC-0412如何通过表观遗传来影响TCA循环。在图A中展示了EPIC-0412与被EZH2识别的lncRNA HOTAIR内的二级结构竞争性结合，从而阻断了PRC2的招募，促使肿瘤抑制基因的表达。为了确定ATF3是否因EPIC-0412调节的H3K27甲基化水平低而被明显诱导，作者进行了ChIP检测以重新验证之前描述的结果。在EPIC-0412处理后，ATF3启动子位点的H3K27me3占用率较低（B），但与RNA pol II的结合率较高（C）。鉴于琥珀酸的水平在EPIC-0412处理后并没有改变，因此作者更加关注将琥珀酸转变为富马酸的蛋白酶，其中SDHA受到了EPIC-0412的调控。同时，用ATF3抗体进行ChIP检测，表明ATF3与SDHA启动子的结合呈阳性（D）。此外，EPIC-0412处理明显导致ATF3与SDHA启动子的结合增加，表明ATF3与SDHA启动子有内在的结合亲和力。与ATF3通过阻断SDHA启动子的激活而抑制其转录的结果一致，与处理细胞相比，EPIC-0412刺激后SDHA的mRNA和蛋白水平都有所下降（E-G）。总之，EPIC-0412可以抑制ATF3调节的SDHA的表达，导致线粒体呼吸中断和胶质瘤细胞代谢反应的改变。

图三：在明确EPIC-0412通过HOTAIR-ATF3-SDHA轴影响胶质瘤细胞中TCA循环，以及AACOCF3能够协同EPIC-0412下调胶质瘤细胞中的ATP产量后，作者进一步探讨肿瘤细胞内ATP含量下降后细胞增殖表型的改变。CCK-8实验与菌落形成实验表现细胞增殖受到抑制，而且联合治疗组对细胞增殖的抑制作用比单药治疗强（A-D）。作者用流式细胞术检测了细胞周期状态结果表明抑制ATP的产生导致细胞周期G0/G1期停滞，并且联合用药对细胞周期G0/G1期停滞的影响比单独用药更明显。WB对G0/G1期特异性检查点标记的检测显示，AACOCF3或EPIC-0412处理G0/G1期特异性检查点的蛋白水平改变(F)。并通过细胞免疫荧光实验测定CDK6蛋白表达水平(G)。并且CDK6荧光强度的定量分析显示，二联组的CDK6水平最低(H)。根据这些结果，作者推测ATP储存可能在调节GBM细胞周期进程和增殖中发挥重要作用。综上所述，这些数据表明，ATP的储存对于GBM细胞周期的调节是必不可少的，而缺乏它会严重削弱细胞的增殖。

图四：为了模拟RTK/RAS/PI3K信号通路的持续激活，作者将EGFR-VIII、mutant-KrasG12S和PTRF-EGFP表达的慢病毒载体导入U87 MG细胞，并验证EPIC-0412跟AACOCF3的治疗作用(A-B)。随后作者评估了转染后U87细胞中的ATP浓度，证实EPIC-0412和AACOCF3仍能下调更恶性的GBM细胞中ATP的产生，与之前一致的是，在抑制剂处理后ATP浓度显著降低，联合治疗比单一治疗更有效(C)。正如之前所证实的，ATP产量的减少有助于将肿瘤细胞转变为细胞周期停滞阶段。细胞周期相关蛋白的WB结果表明即使RTK/RAS信号通路被激活，这种疗法也可以发挥其有效性(D-E)。作者进一步进行了细胞存活率试验(F)和集落形成试验(G)。结果表明，尽管RTK-Ras-PI3K信号通路被激活刺激TCA循环，这种靶向抑制ATP合成的联合治疗可以有效地抑制胶质瘤细胞的生长和增殖。

图五：为了确定脂肪酸代谢和线粒体呼吸在维持体内GBM生长中是否起关键作用，作者建立了裸鼠颅内肿瘤模型(A)。生物发光成像分析显示，单一治疗导致肿瘤生长显著消退，而联合治疗对肿瘤生长的抑制作用更显著(B-C)。从Kaplan-Meier生存曲线可以看出，能量代谢较低的荷瘤小鼠存活时间更长(D)。脑肿瘤组织切片H&E染色显示，有效治疗组肿瘤体积明显缩小(E)。此外免疫组织化学染色显示，GBM细胞的增殖受到严重阻碍，这反映在Ki67(F)和CDK6(G)的水平下降。根据H&E和IHC染色，二联治疗组的肿瘤抑制作用始终强于单一治疗组。综上所述，这些数据表明，抑制ATP合成可以延长荷瘤小鼠的存活率，这可能是治疗胶质母细胞瘤的一种有前途和潜在的治疗策略。

图六：如上所述， EPIC-0412和AACOCF3联合治疗主要破坏了TCA循环和脂肪酸代谢，而没有影响糖酵解。因此，为了阻断糖酵解，作者使用了HK2的选择性抑制剂2-DG(A)。作者分别用EPIC-0412和AACOCF3两联、EPIC-0412、AACOCF3和2-DG三联处理细胞，并同量化PER来评估糖酵解率(B-C)。此外，还检测了细胞内总的ATP浓度(D)。血脑屏障（BBB）被认为是阻碍各种治疗物质向脑瘤血管输送的主要障碍。作者通过微渗透泵绕过BBB，以CED进行了脑内药物的直接输送（E）。通过微渗透泵输送的药物包括DMSO、二联以及三联用药。通过生物发光成像检测肿瘤进展情况（F-G）。从Kaplan-Meier生存曲线中可以看出，与对照小鼠相比，将三联疗法和二联疗法小鼠总生存期增加了（H）。H&E染色同IHC染色结果观察肿瘤体积，增殖率（I）。这些结果表明破坏糖酵解和磷脂代谢以及TCA循环，可以延迟肿瘤的增殖，并延长颅内肿瘤小鼠的中位生存时间。

图七：在这项研究中，作者证明有两个主要的代谢途径产生ATP来支持GBM细胞的能量需求，即脂肪酸氧化和糖酵解（图7）。在脂肪酸途径中，可能大多数FFA是从Land's循环中积累的，其中cPLA2作为一种催化酶，有效地将磷脂水解为溶血磷脂和FFA。作为脂肪酸氧化的基础燃料，脂肪酸在肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1A）的帮助下被运送到线粒体，参与β-氧化，生成乙酰基CoA。此外，葡萄糖作为基本细胞活动的能量生产原料，这在肿瘤增殖中也具有核心意义。HK2作为糖酵解途径的限速酶，在将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸中起着关键作用。因此，作者提出了一个治疗方案，通过肿瘤增殖抑制剂阻断代谢轴。更具体地说，EPIC-0412抑制了SDHA的表达，减缓了TCA循环的周转，从而抑制ATP的合成，AACOCF3是cPLA2的有效抑制剂，可以作为生成FFA的水解酶来抑制FAO，而2-DG作为葡萄糖代谢途径的竞争性抑制剂，通过对肿瘤中HK2的作用抑制糖酵解。

结论：多个重要的代谢酶被改变以维持癌细胞的生长，因此可能反过来成为癌症的特定治疗目标。作者的工作表明，用特定的抑制剂（EPIC-0412、AACOCF3和2-DG）靶向代谢酶（SDHA、cPLA2、HK2）可以极大地降低GBM细胞的ATP生成率，导致肿瘤细胞增殖受到抑制。总之，作者的研究表明通过特异性抑制剂阻断TCA-磷脂-糖酵解代谢轴，可极大地抑制GBM细胞的增殖。

思考：作者课题组早在“PTRF/Cavin1 remodels phospholipid metabolism to promote tumor proliferation andsuppress immune responses in glioblastoma by stabilizing cPLA2” (Neuro oncol,noaa255)对胶质母细胞瘤肿瘤代谢机制进行探讨，研究认为PTRF可通过调节cPLA2蛋白的稳定性和增强cPLA2活性来重构磷脂，进而促进能量代谢，抑制GBM的免疫应答，并且cPLA2抑制剂(AACOCF3)和二甲双胍可逆转PTRF-cPLA2脂质重构通路在GBM中的作用。在这项工作中，作者课题组在延续上一篇针对肿瘤代谢机制的探讨和治疗后，对如何更全面的抑制胶质瘤肿瘤代谢，抑制肿瘤细胞内的ATP产量进行了更深刻的挖掘，并且考虑到表观遗传对肿瘤代谢的影响，作者使用了一种能够阻断lncRNA HOTAIR 与PRC2复合物结合的小分子抑制剂EPIC-0412，从而实现对TCA循环的破坏。本研究通过靶向针对不同代谢途径，实现胶质瘤细胞能量代谢的全方面抑制，进而阻碍肿瘤生长。在探讨清楚糖酵解，脂肪酸氧化，TCA循环在对肿瘤发生发展的影响后，作者课题组将继续探讨肿瘤代谢物对胶质瘤的影响，以及寻找能够同时针对多条代谢途径的靶点基因，进一步探讨蛋白修饰等对该关键基因的调节，从而帮助我们更全面的认识胶质母细胞瘤的肿瘤代谢，敬请期待。

原文：Theranostics 2022; 12(16):7032-7050. doi:10.7150/thno.74197