RNAi实验成功的秘诀

RNA干扰回复实验（Rescue Experiment）:是RNAi一种十分有价值的对照实验来证明siRNA的作用特异性，避免Off-target效应。

回复实验是通过表达目的蛋白的方式回复RNAi的表型效应。目前有两种策略可以检测siRNA效用是通过沉默目的靶标而直接引起的表型效应。

A）用一个带有沉默突变（Silent mutations）cDNA表达质粒回复RNAi表型。（突变型和野生型载体构建见艾博思基因合成）

B）用野生型的ORF cDNA表达质粒与3'UTR区的siRNA组合回复RNAi表型。

实验小提示：过表达蛋白时候可以加一个标签蛋白，这样可以区分内源性和外源性目的蛋白。

siRNA对照，包括普通的阴性对照、荧光标记的阴性对照和siRNA阳性对照

阴性对照：通过打乱最活跃的siRNA碱基序列排列，可以设计一个适当的阴性对照。一定要做好同源性搜索，以确保它与正在研究的生物体基因组缺乏同源性。

荧光标记的阴性对照：荧光标记的siRNA可用于分析siRNA的稳定性和转染效率。标记的siRNA也可用于研究siRNA的亚细胞定位，并可在双标记实验中（使用标记的抗体），追踪转染过程中转入siRNA的细胞以及转染关联的靶标蛋白下调。

阳性对照：对于大部分细胞，管家基因适合作为阳性对照。向靶标细胞转染几个浓度的、对您所选择的阳性对照特异的siRNA。（这也适用于您的试验靶标siRNA。） 转染48小时后，测量对照蛋白或mRNA水平相对于未转染细胞的减少量。太多的siRNA能导致细胞毒性和死亡。艾博思提供适用于各种靶标基因的阳性对照siRNA，常用GAPDH,P53, beta-actin等基因的验证有效的 siRNA（Validated siRNA）。

艾博思生物提醒您：千万别忽视了阳性对照设置，现在发文章是需要提供阳性对照的实验数据的哦！

Mock对照：转染试剂对照组，转染试剂对细胞毒性是影响基因表达的一个重要因素，低毒低剂量高效率转染试剂是您的首选。例如：lipo3000等等。

为了找到一个潜在的靶点，分析感兴趣基因的全长寻找氨基酸序列。记录氨基酸和3′ 19核苷酸作为潜在的siRNA靶点。潜在的靶点随后通过对GenBank数据库的BLAST分析进行评估，去掉任何与其他基因有显著同源性的靶序列。如果可能的话，应该针对含有更少二级结构的靶mRNA区域设计siRNA。每个基因设计并测试两到四条有效的siRNA序列。有效的靶标的表型效应趋向于一致性，并且呈现相应剂量效应。（请选择艾博思生物RNAi套装）

艾博思siRNA设计公式避免同源基因的脱靶效应，选择的siRNA与同源基因之间至少2个或者2个以上的错配碱基。

科研级或者医药级别的siRNA有效序列筛选需要多RNAi进行浓度梯度设置，设置不同浓度梯度，筛选出的有效序列，一定有效浓度低，效率高的靶点，而且效率高外还需要脱靶效应也低。

siRNA有效序列会造成干扰素效应或者毒性以及次级效应。由此通过基因芯片或者RNA-seq的方法检测广谱的基因表达是观察靶点有效性和特异性最直接的证据。（艾博思生物提供基因芯片和RNA-seq服务）

siRNA有效序列需用qRT-PCR和WB在mRNA和蛋白水平进行验证。如果在蛋白水平有高干扰效果而mRNA水平没有变化甚至上调，说明可能是通过类似miRNA方式发生作用而不是通过经典RNAi使得mRNA降解的方式。

参考文献

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