cheRNAs发现之旅

美国芝加哥大学Ruthenburg教授及其同事在2015年《Cell Reports》第一次报导了细胞核级分的染色质捕获的非编码RNA紧邻活性基因。

分析过程主要分为四步：

第一步：细胞核分离

第二步：可溶性细胞核提取物分离和染色质提取物分离

第三步：trizol处理后进行RNA分离

第四步：高通量测序

上图结果显示两个级分中各种类型RNA的丰度。其中包括：

反义RNA（antisense）

长链非编码RNA（lncRNA）

假基因（psseudogene）

编码基因（mRNA）

从图上看出，两个级分中展示了不同丰度的各类别RNA分子。

cheRNAs特异性属性

cheRNA展示一些与普通的增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)不同的分子属性。大部分增强子双向转录，而cheRNA具有特定链的偏好性（specific strand bias）。eRNA典型的标记是H3K4me1和H3K27ac，然而cheRNA与H3K4me3相关。而且，cheRNA比eRNA更长，一般来说cheRNA长度在2000nt左右，而eRNA在350nt左右。

绝大多数的cheRNA附着染色质是通过RNA聚合酶II关联。

cheRNA与毗邻基因的表达显著的正相关。

用CRISPRi研究cheRNAs功能

研究者们将Cas9带到特定的基因组位点，通过起始或停止转录来调控靶基因的表达。CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）就是这样的技术，它们特别适合分析非编码RNA的具体功能。虽然越来越多的研究人员开始使用CRISPRa和CRISPRi。

CRISPRi技术能抑制指定目标的转录，不论是编码还是非编码的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9），dCas9能到达引导RNA指定的位点，但无力对DNA进行剪切（Cell, 152:1173-83, 2013）。当dCas9结合到基因组的时候，会阻断转录机器的结合，阻止这一过程的进行。

改良版CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子（KRAB）的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展，使其难以得到转录。KRAB结构域的使用目前效果很好。

CRISPRi的可逆性是一种特色，不过这也限制了该技术的应用。一些研究者正在利用KRAB结构域让dCas9结合得更加稳定，以实现永久抑制特定位点的转录。人们可以通过这种方法研究表观遗传学标记的跨代遗传。

Werner等在K562细胞中用CRISPRi技术成功抑制三个cheRNA转录。而且利用CRISPRi将cheRNA转录的截断会完全删除对邻近基因的激活作用。

cheRNAs最新应用研究成果：cheRNA可改进干细胞研究

最近研究发现与基因表达密切相关RNA类型大部分是细胞特异性的，由此提出RNA序列可被用作干细胞研究的标记。该研究发表于《Nature Structural and Molecular Biology》杂志上，病理学研究助理教授Vasil Galat博士是本文的共同作者。

只有约20％的RNA编码蛋白质，其余80％称为非编码RNA，它们被认为参与各种细胞过程，包括RNA翻译，剪接和DNA复制。非编码RNA可以进一步分为微笑RNA（microRNA）和长链非编码RNA（lncRNA），超过一半的长链非编码RNA是染色质富集的RNA（cheRNA），其中染色质环绕RNA链周围，RNA聚合酶II结合在基因启动子位点附近。Galat认为这种物理接近性转化为功能连接。

在目前的研究中，Galat和伙伴们发现，cheRNA序列也与不同类型的细胞的遗传表达特异性相关。Galat说：“因为它们与启动子区域相关联，所以它们可以用作启动子区域特定基因的预测因子。一旦你看到cheRNA表达，你可以判断基因的位置。”

生物学家目前使用多种方法来定位基因启动子区域，但是这种方法可以更可靠和更精确。现在，发现cheRNA是细胞型特异性的，在他的主要研究方向中具有特别诱人的应用：多能干细胞。

多能干细胞是未分化的，意味着它们可以发育成人体几乎任何类型的细胞。为保持他们在多潜能的时期是十分困难的，这就是为什么Galat的实验室被邀请与芝加哥大学先导项目合作。

“我们的实验室在多功能细胞方面有着丰富的经验，”Galat说。 “这些细胞需要维持的经验。他们在培养中一直在自发地分化。”

理论上，通过建立细胞类型和相关的cheRNA的数据库，可以将cheRNA用作标记物，以缩小多潜能干细胞正在转化为那种类型，这是目前设备解决这个问题的难点。

“许多类型的细胞在培养中看起来非常相似，”Galat说。 “您可以检查标记，但是许多标记重叠 - 因此要区分单细胞类型，您必须使用许多标记。相反，如果您可以分离cheRNA，它可以定义您正在处理的细胞种类以及它们的功能成熟程度。”他甚至希望科学家可以在将来的某个时候使用cheRNA来积极地指导分化过程。

对多潜能细胞的更精确的操作可以加速具有特定功能的遗传工程细胞进程， 例如，创建免疫系统的高度功能性细胞，其几乎涉及健康的各个方面。“这是cheRNA最有趣的特征，”Galat说。 “它可以作为表征细胞类型的一种方法，也可以作为一种将多潜能细胞引导到特定细胞类型的方法。”

cheRNAs明星分子：PVT1和HIDALGO

1.cheRNA组织特异性和顺式作用活性

2.PVT1与靶基因结合调控MYC基因转录

3.CRISPRi和ASO验证HIDALGO促进HBG1表达

4.HIDALGO在转录起始位点偶联增强子到HBG1启动子增强表达

本文作者描述了一类新长链非编码RNA（cheRNA），其特征是特别紧密的染色质关联，其存在与附近基因的表达强烈相关。本文作者检测了cheRNA在多种人类细胞系中的顺式增强子机制。cheRNA主要是细胞类型特异性，并提供最可靠的染色质信号特征来预测每种检测的人类细胞类型中的顺式基因转录。CRISPRi和ASO靶向三个cheRNA靶标的基因敲低，降低了其相邻基因的表达，表明潜在的辅助激活功能；cheRNA与远端靶基因“配对”的单分子荧光原位杂交（smFISH）表明他们在空间上重叠参与染色质环化作用。此外，cheRNA HIDALGO通过促进与下游增强子的接触来刺激红细胞分化期间的胎儿血红蛋白亚基γ1（HBG1）基因。总之本研究结果表明多个cheRNA分子激活近端谱系特异性的基因转录。

参考文献：

1.Werner M S, Ruthenburg A J. Nuclear fractionation reveals thousands of chromatin-tethered noncoding RNAs adjacent to active genes[J]. Cell reports, 2015, 12(7): 1089-1098.

2.Gayen S, Kalantry S. Chromatin-enriched lncRNAs: a novel class of enhancer RNAs[J]. Nature structural & molecular biology, 2017, 24(7): 556.

3.Werner MS, Sullivan MA, Shah RN, Nadadur RD, Grzybowski AT, Galat V, Moskowitz IP, Ruthenburg AJ. (2017) Chromatin-enriched lncRNAs can act as cell-type specific activators of proximal gene transcription. Nat Struct Mol Biol 24(7):596-603.