聊聊LncRNA研究的细节

前世今生是现在电视剧的热门词汇，而对于科研工作者而言，前世今生就是追根溯源，是科学研究的脉络与逻辑。在基金申请来说，前世今生就是研究前期基础以及科研方向，或者标的物探索的延续性。

对于科研的初学者而言，看见一篇本领域题为《SENCR stabilizes vascular endothelial cell adherens junctions through interaction with CKAP4》的文章。首先映入脑海的是本文四个关键词是long-noncoding RNA（SENCR）、endothelial cell(Vascular) 、shear stress、adherens junction。一篇文章一个好的标题，一方面吸引读者的注意力，一方面代表的文章的创新点。SCI论文的标题是文摘、索引或提录等情报资料的重要组成部分。要求准确（accuracy）、简洁（brevity）、清楚（clarity）和吸引人（attractive），反复斟酌后确定标题 。当小艾第一眼看见这个标题就知道作者研究的是长链非编码RNA SENCR，研究的模型与血管内皮细胞的粘附连接（adherens junctions ）相关，第一次发现SENCR与CKAP4相互作用。如果您是研究方向是lncRNA，疾病是心血管方向，或者以前你研究过CKAP4这个基因，那么你对这篇文章就有读一读的想法了。一个标题，几个关键词让你的文章漂洋过海找到心仪的读者。

进一步读文章，小艾就有一个疑问，SENCR这个lncRNA是作者首次发现？或者是拿来主义？还是延续性研究？这也是很多小白研究者读文献必须思考的，如何查研究的脉络？首先，小艾带着这个疑问，搜索的文章通讯作者的研究方向和研究论文，《Identification and Initial Functional Characterization of a Human Vascular Cell Enriched Long Non-Coding RNA》的通讯作者Joseph M，Miano对SENCR发现是具有原创性的。

作者在2014年发表在《Arterioscler Thromb Vasc Biol.》（IF：6.086）第一个针对人体冠状动脉平滑肌细胞进行lncRNA的RNA-SEQ测序，经过测序结果分析，他们发现了这个lncRNA命名为“SENCR”。经过研究后发现，在血管平滑肌细胞和内皮细胞中“SENCR”是最丰富。“SENCR”是胞质定位的lncRNA，如果通过RNAi降低“SENCR”表达，导致了心肌素及平滑肌收缩相关的功能基因表达的下调，另一方面，许多促进迁移相关的基因表达升高（即SENCR能够抑制这些迁移相关基因）。本文研究的一大特色就是组织的特异性：平滑肌细胞和内皮细胞特异高表达的lncRNA。

小艾同学又有了一个疑问，为何选择组织特异性的lncRNA？为何选择特异性高表达的lncRNA？小艾猜测：组织特异性表达决定了机制的特异性，在组成型表达研究中当然选择高表达，说明它功能的重要性。只有当发生标的物lncRNA的扰动时候，异常低表达也是机制的一种，所以在lncRNA差异表达谱中我们会选择高表达和低表达作为候选lncRNA。组织特性还带来治疗手段的特异性，总之时空特异性是机制与治疗之本。

下面在再来聊聊：《SENCR stabilizes vascular endothelial cell adherens junctions through interaction with CKAP4》(IF:9.504）

提出科学问题是科研的功底。首先我们从疾病入手，冠心病的病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)，其发生与较多全身性危险因素引起的内皮功能紊乱、脂质聚积、炎性细胞浸润等密切相关，AS好发于动脉分又的外侧壁和弯曲的内侧壁。斑块的非随机分布与冠状动脉内血液流动模式及相应流体力学有关，后者主要包括血流产生的内皮剪切力和血压产生的周向应力，其中以内皮剪切力作用为主。血管内皮是由附着于血管内部的薄层内皮细胞构成，是重要的信号传导介质。血流通过对血管内壁施加剪切力进而影响内皮生理功能，引起一系列级联反应，参与AS的发生、发展。冠状动脉内的血流按流动形式可分为层流和湍流，层流是一种线型流动，可分为以光滑线型为特征的稳定层流和以回流或周向旋转为特征的扰动层流。湍流是指血流速度随时间变化而不断变化的一种流动形式。从几何角度来说，血流是层流还是湍流是由雷诺数(Re)决定的，当Re<2000，血流表现为层流，Re>2000为湍流J冠状动脉内的血流模式与冠状动脉复杂的几何构型密切相关，前者决定内皮剪切力的大小和方向，进而决定了剪切力的类型。在管腔平直部位，血流表现为单向稳定层流，即层流剪切力(Laminar shear stress，LSS)，剪切力大小为15～70dyn／cm。在管腔形状不规则部位，血流表现为扰动层流，不稳定的血流产生低剪切力和振荡剪切力(oscillating shear stress，OSS)。探索机制：临床方面的科研，临床病例的理解医生更有话语权，病理现象与机制的假设就是一个好的课题。将SENCR与层流剪切力建立了相关性，就是本文的最大亮点。剪切力影响着细胞各种进程，本文着重选择了层流剪切力对细胞粘连反应的影响。紧接着，SENCR功能丧失（Loss of Function）研究揭示了EC膜完整性的扰动导致EC渗透性增加。生物素化RNA pull-down和质谱结合发现了一个高丰度的SENCR结合蛋白，即细胞骨架相关蛋白4（CKAP4）；使用CKAP4抗体用RNA免疫沉淀实验进一步证实了该核糖核蛋白复合物。结构与功能(Structure–function)研究证明CKAP4中的非经典RNA结合结构域能够结合SENCR。在SENCR敲低后，在EC表面部分中检测到CKAP4蛋白水平增加。此外，在SENCR降低（Knock Down）EC中CKAP4和CDH5之间的相互作用增强。这种高度关联性似乎使CDH5/CTNND1复合物不稳定并增加CDH5内化，导致粘附连接受损。这些发现支持SENCR作为流动响应性（flow-responsive）lncRNA，其通过与CKAP4的物理结合促进EC粘附连接完整性，从而稳定细胞膜结合的CDH5。以上阐述似乎就进入标准科研套路了。

以下是前后两篇文章的采用的技术对比表：

小艾思考，自己的财力和技术手段能否发一篇9分的《PNAS》？从技术手段和方法就要提前预估。就像你写基金中的经费预算与所采用的技术方法一样。

小艾总是有些疑惑，做应用或临床研究的是否要对某一项技术应该有所了解了？回答是一定是肯定的。任何技术都有优缺点，任何技术都有限定的应用范围，当你应用某个工具做研究的时候，知道方法的机制和优缺点是辅助你的机制和应用的前提条件，当你作为审稿人的时候，你对技术已经胸有成竹，那么你本科或者研究生时候的bench work就显得格外重要了，因为那个时候你心无旁骛的在钻研着技术呢！

刚入门的RNAi初学者，一下子要做lncRNA的RNAi，看看艾博思给你提醒（lncRNA功能研究之： RNA干扰问题解答）.

2014年论文中使用了Dicer Substrate RNAi Design设计方案，作为技术控的科研人员，就迫不及待要知道这个与普通siRNA有什么不同呢？DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT)目前一直保留一种获得有效的27-mer Dicer酶作用（Dicer-substrate）siRNA双链的方法。通过这种方法，可以获得有效预设 siRNA双链。 

Dicer-Substrate siRNA技术原理

之前的研究认为在没有引起干扰素应答（interferon response）的条件下，只有21-23nt双链siRNA才能激活RNAi途径，但是来自美国希望之城国家医学中心（the City of Hope）和IDT的研究人员证明无干扰素应答激活的前提下，27-nt的siRNA双链实际上能有效的激活RNAi途径，并且比经典的21-mers siRNA更早激活这一途径。这些研究数据表明27-nt双链是由RNaseIII家族成员：Dcicer酶加工获得的，而且27-mer siRNAs常常表现出比21-mer siRNA能更有效的RNA干扰效果。

Dicer-Substrate siRNA双链

因此在这一理论基础上，IDT建立了27-mer设计运算法则（algorithm），相关生物信息学和高质量合成方法，并推出了Dicer-substrate siRNA双链合成。这些双链已由Bio-Rad研发部专家经过了性能验证和有效性验证，可以减少至少85%的mRNA表达。除此之外，这种siRNA对于建立有效siRNA库也很合适，多种靶标的多siRNA双链合成可以产生复合生物学效应，有利于特异兴趣基因的确定敲除。

减少脱靶效应

当siRNA序列与兴趣基因非特异性序列mRNA转录本相似的时候就会产生脱靶效应（off-target effects），这会引起基因表达谱的错误识别，从而导致与目标基因无关的转录本沉默。

为了避免这种情况出现，Dicer-substrate siRNA双链：

•利用先进的生物信息学对敲除特异性同源序列进行分析，确保特异靶标。 

•低浓度（(≥5 nM）有效性：在siRNA高浓度的时候才会发生脱靶效应，为了减少这一效应，siRNA在低浓度时提高了有效性。 

•HPLC级纯化siRNA保证了一致和可靠的结果。

看见了某一项技术宣传，你可能就对它跃跃欲试，但是了解技术是一方面，使用技术就是另外一方面，你需要考虑其使用范围，到货期，成本等等一系列因素。

PNAS文章使用的是普通的化学合成siRNA，这种siRNA又有什么讲究呢？最大讲究是设计原则，设计原则是化学合成siRNA核心。此处请让小艾同学做个广告，广告很精彩！

RNAi实验的方法有好几种，如果说选择一种最简单、快速的方法，当然是使用化学合成的siRNA（稳转除外），且沉默结果的重复性相比其他方法更好。艾博思公司不仅在siRNA序列上拥有先进的设计法则和合成技术，还提供了包括siRNA转染、沉默后结果验证的全套实验工具，可以让大家轻松拿到成功的RNAi结果。 

艾博思公司的siRNA序列设计法则是基于神经元网络算法而开发的，并且艾博思提供的siRNA是通过复杂的运算后进一步经过一系列严格的分析才获得的。

LncRNA siRNA设计最大的难点就是同源性分析工具：使用最新的序列数据库进行同源性分析，确保siRNA的准确性。  

序列稳定性不对称原则：确保反义链有效进入RISC，减少Off-target脱靶效应。 

3’UTR区域分析：siRNA反义链的2-7位碱基（seed region）与非目标基因的3’UTR通过类似miRNA的方式进行非特异性沉默，严谨的比对3’UTR/ seed region减少了脱靶效应。 

干扰素位点屏蔽：一些序列motifs会引起细胞的干扰素反应，含有这些motif的siRNA会被设计体系剔除。 

SNP位点屏蔽：跨SNP位点的siRNA在某些实验中效率可能会下降，因此排除掉这些siRNA可提高siRNA的效率。 

艾博思设计出针对人、小鼠、大鼠全基因组的siRNA, 覆盖了>73,000个基因。通常艾博思为每个基因或者lncRNA提供3条siRNA针对同一mRNA不同的区域，便于验证沉默效果的特异性,如果客户追求高质量的品质的文章和结果，建议选择4-5条序列的设计，实验者选择2条或以上有效序列进行后续实验，以免投稿时候审稿人提出疑问，补实验就是头疼事情。 

PNAS文章即使用了siRNA又使用了shRNA，那么siRNA与shRNA又有什么不同呢？这个是深入了解技术的小艾心头疑惑，那么我们就开始答疑解惑吧！

要回答这个问题，首先看看2张图

现在常用的RNAi的研究策略有三种：

第一种即为直接合成针对靶基因的siRNA(合成的是RNA,不是DNA),通过转染（有用于siRNA转染的试剂）的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。这一方法受转染效率的影响较大，而且能顺利的进入RNAi途径的效率怎么样，还有待验证。而且直接合成的siRNA可以进行小分子多肽等配体标记，可进行体内研究，注入体内后，通过配体的识别，被特定的细胞吸收，在特定的靶细胞内实现RNAi研究。

效果快 24-72h，持续时间短，效率高

二是构建shRNA的质粒表达载体，转染细胞，在细胞内转录生成shRNA,利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。

起效时间48-96h，持续时间长，效率中等，需要载体构建步骤，但是长期使用成本低。发夹结构和载体本身的序列存在毒性效应的可能。shRNA进入细胞需要DICER切割，切割效率和微环境影响对于shRNA有一定制约，PNAS文章用siRNA筛选的靶点转换成shRNA效用依然很高，这种情况存在，但是也存在不作用的风险，shRNA可以加抗生素标记和荧光标记可以做成稳转细胞株，方便动物实验。

三是构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。将siRNA序列作为“短发夹”克隆进载体如腺病毒载体中，当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA，short hairpin RNA)，并被RNAi通道处理。短发夹样RNA－shRNA. 在细胞内会自动被加工成siRNA，使靶基因沉默，且比siRNA 作用更稳定、高效。

PNAS文章即使用了siRNA没有使用ASO，那么siRNA与ASO又有什么不同呢？

首先我们看看机制的不同：

ASO是单链而siRNA是双链，而它们各自作用机制不同。

以上是ASO和siRNA在克服各自应用缺陷所采取方法的异同。

siRNA主要发挥作用在细胞质，ASO主要在细胞核，CRISPR/Cas9直接靶向DNA。

lncRNA分为三种：细胞核定位，细胞质定位，细胞质和细胞核双定位

我们来看看ASO和RNAi的区别。

细胞核定位的ASO效果优势十分明显。

细胞质定位的RNAi效果有优势。

细胞核与细胞质双定位的ASO效果有优势！

至于CRISPR/Cas9那就是概率论和成本论了，目前策略主要是双sgRNA大片段缺失策略。

艾博思为您提供三种ASO解决方案！

最后小艾给一张探索策略图，供大家参考！

后记：

文章从低分到高分是一个培训的过程，技术从简单到复杂，到多元化是一个科研工作者升华的过程。不同的角度看到不同的细节。浩瀚的科研之海，等待着我们去探索，着眼于临床的科学问题，用技术细节挖掘其中的奥妙。

参考文献：

Lyu, Qing, et al. "SENCR stabilizes vascular endothelial cell adherens junctions through interaction with CKAP4." Proceedings of the National Academy of Sciences (2019): 116 (2) 546-555.